Tiosbio® RAA核酸扩增试剂盒（基础型）
Cat. No. JY0200
工作原理:
本试剂盒采用重组酶介导等温核酸扩增（Recombinase Aided Amplification，RAA）技术对检测目标序列进行扩增，产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
RAA是一种等温核酸扩增技术，在等温条件下（通常为39℃），重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体 Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白 SSB 的帮助下，侵入双链DNA 模板；在侵入位点形成 D-loop 区域，并开始对 DNA 双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体 Rec/ssDNA 解体的同时，聚合酶也结合到引物的 3′ 末端，以样品DNA为模板，30 ~ 40 min即可实现对目的基因片段的高效扩增。
正、反向引物建议的设计长度为30 ~ 35 nt之间，长度通常长于PCR引物。引物过短可能会降低反应重组率，响扩增速度和检测灵敏度；引物过长则有可能形成二级结构而影响扩增。引物浓度应根据模板的浓度进行筛选，以确定最佳浓度，提升扩增效率。扩增片段的长度推荐为150 ~ 300 bp，通常不超过 500 bp。注意，模板DNA片段过长或出现重复序列时，扩增的准确性会降低。
预期用途:
本试剂盒仅供科研使用，适用于各种DNA模板的扩增，核酸扩增产物可采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
试剂盒组成：
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组分
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JY0200（48T）
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数量
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A buffer
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1.6 mL
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1
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B buffer
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150 μL
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1
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阳性对照模板
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30 μL
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1
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阳性对照引物Mix
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60 μL
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1
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反应单元
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48管
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48
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使用说明书
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1份
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1
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包装规格/货号:
包装规格：48次，货号JY0200。
储存条件及有效期:
-20℃避光保存，有效期14个月，避免重压和反复冻融。反应单元开封后，须当天用完。
操作步骤:
1. 提前 30 min将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
2. 每个干粉反应管加入 29.4 μL A buffer（注意：A buffer 需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响）；
3. 建议加样顺序为阴性质控样本、待检样本和阳性对照，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免污染。
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组分
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用量（μL）
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A buffer
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29.4
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正向引物（10 μM）
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2
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反向引物（10 μM）
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2
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核酸模板
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2 ~ 14.1
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以水补足体积至
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47.5
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注：阳性对照反应单元体系配制：阳性对照模板加入 2μL，加入 4 μL 阳性对照引物 Mix（包含上、下游引物）。其他组分参照体系配制。
每个反应管分别加入 2 μL 正向引物和 2 μL 反向引物（引物浓度 10 μM，对于多个反应、步骤 1 和步骤 2 可以混合后再分装至反应管中）；向反应管中依次加入 12.1 μL ddH2O 和 2 μL 核酸模板（可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积，并相应调整加入的 ddH2O 体积，至模板与 ddH2O 总体积为 14.1 μL）。
4. 最后向反应管中加入 2.5 μL B buffer 并充分混合（请务必上下颠倒甩动反应管 8 ~ 10 次进行混匀（可涡旋混匀）；对于多个反应，建议将 B buffer 加至反应管的盖子内侧上下颠倒后混匀）；
5. 混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中。
6. 37 ~ 39 ºC 孵育 30 min。
7. 反应结束后，加入 50 μL酚/氯仿（1:1），充分振荡均匀，注意，该步骤可使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。12000 rpm离心5 min，取 5 μL 上清进行琼脂糖凝胶电泳（胶浓度一般为1.5 % ~ 2 %）检测。
图1 阴性对照（N）和阳性对照（P）的RAA扩增及电泳检测
检测灵敏度:
本试剂盒检测极限约为1×102拷贝/反应（试剂盒的检测灵敏度与目的序列的GC含量及引物的扩增效率有关）。
注意事项及安全提示:
1. 本产品仅供科研使用。使用前请仔细阅读说明书，严格按照说明书操作。违反或者未按说明书进行操作可能导致错误结果。
2. 产品应依照说明书要求，储存于合适的环境和温度下，并在有效期内使用。储存不当或产品过期可能导致错误结果。
3. 为避免交叉污染，试剂配制区及检测区应分隔开。
4. 实验需设置不加模板的空白对照，以确认是否有待扩增核酸的污染。
5. 如用于病毒等病理样品检测，所有检测样本及试剂均按照传染性物质对待，实验过程中穿工作服，戴一次性手套，并经常更换手套，以做好工作人员的防护并避免交叉污染。
6. 不能使用过有效期的产品。
